Durante séculos, os cientistas notaram que certas doenças parecem ser transmitidas de uma geração para outra, uma ligação notada pela primeira vez por Hipócrates, que observou que certas doenças “ocorrem em famílias”. Ao longo do tempo, os investigadores melhoraram constantemente a sua capacidade de revelar as raízes biológicas destes padrões genéticos no genoma humano.
Uma equipe de pesquisadores e colaboradores do EMBL criou agora uma ferramenta que leva a análise de células únicas para o próximo nível. Ele pode capturar variação genômica e RNA dentro da mesma célula, proporcionando maior precisão e escalabilidade do que as tecnologias anteriores. Esta abordagem permite aos cientistas identificar variações em regiões não codificantes do ADN – regiões mais frequentemente associadas a doenças – dando-lhes uma nova forma de explorar como as diferenças genéticas afectam a saúde humana. Com a sua precisão e capacidade de processar um grande número de células, a ferramenta marca um passo importante na ligação de variantes genéticas específicas aos resultados de doenças.
“Este é um problema de longa data porque os atuais métodos unicelulares para estudar DNA e RNA na mesma célula têm rendimento limitado, carecem de sensibilidade e são complexos”, disse Dominik Lindenhofer, autor principal de um novo artigo sobre SDR-Seq publicado em SDR-Seq. método natural e pesquisador de pós-doutorado no grupo de Steinmetz no EMBL. “No nível de célula única, você pode ler variantes em milhares de células, mas apenas se elas forem expressas – e, portanto, só podem ser lidas na região de codificação. Nossa ferramenta funciona independentemente de onde a variante está localizada, produzindo números de células únicas capazes de analisar amostras complexas.”
Diferenças importantes entre regiões codificantes e não codificantes
O DNA contém regiões codificantes e não codificantes. A parte codificadora funciona como instruções porque seus genes são expressos como RNA, instruindo a célula a construir as proteínas necessárias à vida.
As regiões não codificantes, por outro lado, contêm elementos reguladores que direcionam o crescimento e a função celular. Mais de 95% das variações de DNA associadas a doenças ocorrem nessas regiões não codificantes, mas os métodos unicelulares existentes ainda não têm sensibilidade ou escala para estudá-los efetivamente. Até agora, os investigadores não conseguiram observar ADN e ARN na mesma célula em grande escala, limitando a compreensão de como as variações do ADN afectam a actividade genética e conduzem a doenças.
“Neste espaço não codificado, sabemos que existem variantes associadas a condições como doenças cardíacas congénitas, autismo e esquizofrenia que ainda não foram exploradas, mas estas certamente não são as únicas condições”, disse Lindenhofer. “Precisamos de uma ferramenta para explorar e entender quais variantes são funcionais no contexto do genoma endógeno e entender como elas contribuem para a progressão da doença”.
Decifrando os códigos de barras que rastreiam células individuais
Para realizar o sequenciamento de DNA-RNA unicelular (SDR-seq), os pesquisadores usaram minúsculas gotículas de óleo-água, cada uma contendo uma única célula, permitindo-lhes analisar DNA e RNA simultaneamente. Essa abordagem permitiu examinar milhares de células em um único experimento e vincular diretamente as alterações genéticas aos padrões de atividade genética. O desenvolvimento desta tecnologia exigiu a superação de desafios significativos e reuniu equipes das Unidades de Biologia do Genoma, Biologia Estrutural e Computacional do EMBL, da Escola de Medicina da Universidade de Stanford e do Hospital Universitário de Heidelberg.
Judith Zaugg e colaboradores do grupo de Kyung-Min Noh no EMBL desenvolveram um método para preservar o delicado RNA “consertando” células, enquanto biólogos computacionais do grupo de Oliver Stegle projetaram um programa especializado para decodificar o complexo sistema de código de barras do DNA necessário para a análise de dados. Embora o software de decodificação tenha sido construído para este projeto específico, a equipe acredita que ele poderá ser valioso para muitos outros estudos.
Pesquisadores das equipes de Wolfgang Huber e Sasha Dietrich do EMBL e do Hospital Universitário de Heidelberg já estão examinando amostras de linfoma de células B para estudos adicionais. Estas amostras de pacientes, ricas em variação genética, fornecem casos de teste ideais para novas tecnologias. Lindenhofer usou essas amostras para observar como as variações do DNA se relacionavam com o processo da doença e descobriu que as células cancerígenas com mais variações apresentavam sinais de ativação mais fortes que apoiam o crescimento do tumor.
“Estamos usando essas pequenas câmaras de reação para ler DNA e RNA na mesma célula”, disse Lindenhofer. “Isso nos permitiu determinar com precisão se uma variante estava presente em uma ou ambas as cópias de um gene e medir seu impacto na expressão gênica na mesma célula. Usando células de linfoma de células B, fomos capazes de mostrar que, dependendo da composição variante das células, elas têm propensões diferentes de pertencer a diferentes estados celulares. Também pudemos ver que o aumento de variantes nas células estava, na verdade, associado a estados de linfoma de células B mais malignos.”
As muitas oportunidades apresentadas pelas ferramentas de sequenciamento unicelular
As ferramentas SDR-seq agora fornecem aos biólogos do genoma escala, precisão e velocidade para ajudá-los a compreender melhor a variação genética. Embora possa eventualmente desempenhar um papel no tratamento de uma variedade de doenças complexas, pode primeiro ajudar a desenvolver melhores ferramentas de rastreio diagnóstico.
“Temos uma ferramenta que pode vincular variantes a doenças”, disse Lars Steinmetz, autor sênior do artigo, líder do grupo EMBL e professor de genética na Faculdade de Medicina da Universidade de Stanford. “Essa capacidade abre uma ampla gama de áreas biológicas que podemos agora descobrir. Se pudermos discernir como as variantes realmente regulam a doença e compreender melhor o processo da doença, isso significa que temos uma melhor chance de intervir e tratá-la.”
